湖北民族大学研究生，湖北民族大学研究生院
优质红米和黑米中蛋白质、氨基酸、微量元素等有益成分的含量高于普通稻米；研究人员检测163 个黑米品种蛋白质含量，显示蛋白质含量比普通早籼米平均高出近10%；有色稻米中如花青素、VE、强心苷等药用成分，可能赋予红米及其产品降胆固醇、降血糖、抗肿瘤和抗氧化的功效。研究显示，红米可显著提高大鼠血浆高密度脂蛋白水平，这很可能是红米中多种有益成分综合作用的结果。目前有色稻的品质改良取得了不少进展，但总体而言，红米稻中有益人体营养与健康的因子有待充分发掘。随经济社会发展，亟需加强对红米稻中有益资源进行深入发现和运用。
湖北民族大学生物与食品工程学院的汪海洋、王喆皓、方 庆*等针对红米稻中一个响应外部环境胁迫的过氧化物还原酶基因OsPrx3，采用原核表达技术表达该基因编码蛋白，对摄入OsPrx3蛋白的秀丽隐杆线虫进行处理，鉴别目的蛋白OsPrx3对动物抵抗氧化应激等方面的有益活性和功能，以期为促进红米稻中潜在有益营养与健康重要因子的发现和应用提供基础。
1、红米稻OsPrx3基因及其蛋白体外表达
红米稻中OsPrx3基因预编码一个过氧化物还原酶，半定量逆转录PCR结果显示OsPrx3基因响应外部胁迫（图1A）。当用高温（42 ℃）和紫外处理红米稻幼苗植株，在相对初始处理时（0.5 h），OsPrx3表达水平持续（监测时点1.5～3.0 h）明显升高。OsPrx3表达水平提升很可能有助于红米稻抵抗氧化应激。
克隆红米稻中OsPrx3基因全长ORF DNA序列，测序分析发现其碱基序列与日本晴水稻中的同源基因（LOC_Os01g48420.1）完全一致。OsPrx3预编码一个含162 个氨基酸的过氧化物还原酶，其多肽链与模式植物拟南芥中的同源蛋白（At1G65970.1）进行氨基酸序列比对，显示第51位半胱氨酸（“#”所示）附近存在该家族共有的保守位点（图1B）。该第51位半胱氨酸残基很可能是支持其酶活的关键位点。为实现目的基因高量表达，构建目的基因原核表达载体，转化大肠杆菌BL21细胞后，进行目的蛋白诱导分离，图1C显示目的蛋白纯化效果较好，OsPrx3蛋白分子质量近24 kDa。
2、OsPrx3体外酶活力分析
为探索OsPrx3抵御氧化作用，H 2 O 2 清除实验结果显示，添加1、2 μg/mL目的蛋白，反应5 min，对H2O2清除率显著提升，分别可达40%和80%以上。而对照BSA体系中H2O2含量无明显变化。比较而言，添加目的蛋白OsPrx3质量浓度越高，初始消除H2O2效率越高；例如，2 μg/mL OsPrx3在反应2.5 min的H2O2清除率可达同等条件下1 μg/mL的3 倍；并且，无论是使用1 μg/mL或2 μg/mL质量浓度，实验时长内（10 min）目的蛋白对H2O2总体清除率均可达80%（图2）。可见，大肠杆菌细胞表达的目的蛋白OsPrx3在体外能有效抵御H2O2氧化作用。
3、OsPrx3增强线虫抵抗氧化
为鉴别OsPrx3蛋白对秀丽线虫抵抗氧化应激的影响，用5 mmol/L H2O2处理饲喂目的蛋白后的线虫，比较线虫的存活率。结果显示，在受到氧化的初始10 min和15 min内，处理组线虫存活率仍达90%以上，比对照组高出近15%（图3）；而随后20、25 min和30 min，处理组与对照组线虫存活率无明显差异。以上显示，在氧化胁迫较早时期，OsPrx3蛋白能一定程度上显著提升线虫抗氧化能力（P＜0.01）。
4、OsPrx3蛋白降低线虫ROS水平
如图4所示，与Vector-CK对照组相比，摄入OsPrx3蛋白的线虫体内ROS水平显著降低（P＜0.001）。OsPrx3蛋白被摄入后可能引起线虫体内ROS调节网络改变，减少ROS过量累积，从而表现出氧胁迫保护效益。
5、OsPrx3蛋白降低线虫脂肪含量
结果显示，OsPrx3蛋白摄入的线虫脂肪沉积显著小于Vector-CK对照组（P＜0.001）（图5）。脂肪沉积是体内细胞代谢尤其是脂质代谢水平的间接反映。ROS水平与细胞代谢活性紧密联系。处理组秀丽隐杆线虫摄入OsPrx3蛋白后，体内ROS水平显著降低，预示细胞代谢活性增强，这可能也是处理组线虫脂肪累积显著降低的主要原因。
6、抗氧化基因的表达水平分析
图6结果显示，摄入OsPrx3蛋白后线虫体内抗氧化关联基因的表达显著改变。其中，相比Vector-CK，ISP-1、SKN-1和CTL-1基因的相对表达水平分别增加到（3.65±1.36）、（3.63±0.94）倍和（5.30±0.49）倍。
结论
借助大肠杆菌细胞成功表达红米稻过氧化物还原酶基因OsPrx3，分离目的蛋白，体外实验显示该蛋白具有较高酶活性，5 min内1 μg/mL OsPrx3对H2O2相对清除率可达40%以上；与对照相比，摄入目的蛋白的秀丽隐杆线虫，运动能力和体长虽无明显变化，但抵抗外部氧化应激的能力却在氧化处理的15 min内明显增强，而且体内活性氧、细胞脂肪含量显著降低；另外，部分调节氧化的关键基因表达明显上调。基因工程策略成功表达红米稻过氧化物还原酶OsPrx3基因，其产物OsPrx3体外具有较高抗氧化活性，秀丽隐杆线虫摄入该蛋白能显著增强抗氧化能力。
通信作者
方庆，男，汉族，湖北民族大学生物与食品工程学院教师，博士，副教授，硕士生导师。主要研究方向包括植物逆境适应性调控与蛋白工程等。先后主持或参与国家自科基金、中国博士后基金、中央高校科研业务专项、湖北省自科基金、湖北民族大学创新研究团队项目等科研项目。已发表研究论文或报告20余篇，申请国家发明专利两项，其中第一或通讯作者期刊论文十余篇，SCI 论文7篇；入选湖北民族大学学科骨干人才项目。
第一作者
汪海洋男，汉族，硕士。2018年毕业于湖北民族大学生物工程专业，2022年硕士毕业于湖北民族大学生物与食品学院，专业为粮食、油脂及植物蛋白工程，研究方向为食品生物技术。研究生期间发表研究论文四篇，其中CSCD论文一篇，SCI论文一篇。在读期间获得研究生奖学金三次。
本文《红米稻过氧化物还原酶OsPrx3增强秀丽隐杆线虫抗氧化功能》来源于《食品科学》2023年44卷6期197-204页，作者：汪海洋，王喆皓，黄卉，沈焕然，宋小雨，王智勇，卢延克，周志，方庆。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220422-297。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
图片来源于文章原文及摄图网。
为进一步深入研究食品产业科技创新基础理论，保障食品质量与安全，研发具有营养和保健功能的食品，推动食品科学研究的进步，带动食品产业的技术创新，更好地保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志在成功召开前十届“食品科学国际年会”和四届“食品科学与人类健康国际研讨会”及二十余次食品专题研讨会的基础上，将与国际谷物科技协会（ICC）、南京农业大学、南京财经大学、江苏省农业科学院、徐州工程学院、东南大学营养与食品卫生系于 2023年8月5-6日在中国江苏南京 共同举办“第十一届食品科学国际年会”。
湖北民族大学研究生(湖北民族大学研究生院)
